基因編輯動物凈化之——基因型鑒定

　　各位童鞋，考考你們基因工程小鼠成功繁育之后應該做什么呢?

　　機智的你們一定能想到是基因型鑒定啦!

　　基因型鑒定在基因工程小鼠應用中不可或缺，在很多同學眼里這可能是一項基礎性的工作，但實際上里面有N多小細節需要注意，下面就由小編帶你一起get小鼠基因型鑒定吧!

　　一、小鼠尾基因組DNA的制備

　　提到基因型鑒定，腦海中是不是閃現出“鼠尾DNA提取 PCR”的關鍵詞呢?

　　沒錯，鼠尾基因組DNA的制備是基因型鑒定的第一步，也是整個實驗中至關重要的步驟，其中有很多容易忽視的地方需要我們注意哦!

　　1. 樣本準備

　　在基因型鑒定中，小鼠基因組DNA的制備是決定實驗結果好壞的關鍵。根據經驗，一般選擇在小鼠出生3-4周剪尾。

　　注意：① 鼠尾尾尖(<5mm)可獲得的DNA量足夠用于基因型鑒定。

　　② 剪鼠尾的剪刀每剪完一次需用酒精棉擦拭，避免DNA交叉污染。

　　③ 避免鼠尾樣本帶有血液。

　　2. DNA抽提

　　1)將鼠尾剪碎，離心管中加入500uL裂解液和適量15 uL蛋白酶K(10 mg/mL)。

　　2)樣本浸于溶液中并充分振蕩混勻，置于55℃恒溫加熱儀。

　　3)加入500uL DNA提取飽和酚和500uL核酸提取液，12000 rpm離心10 min，離心后將上清液轉移至新離心管中。

　　4)上清中加入1mL無水乙醇(約2倍體積)，上下輕晃，直至出現絮凝的DNA沉淀，8000 rpm離心3 min，棄上清。

　　5)加75%的酒精1mL洗滌，12000 rpm離心5 min，棄上清，留沉淀，倒置干燥5 min。

　　6)加入200 µL DEPC水(可根據DNA量調節)，使沉淀完全溶解，于-20℃保存備用。DNA 樣品的 OD260/280 在 1.8-2.0 之間。

　　注意：① 需要充分裂解鼠尾，樣本應消化至肉眼看不到大顆粒為止。

　　② DNA模板濃度應控制在50-100ng/ul進行PCR。

　　二、PCR

　　成功的PCR擴增產物不僅需要高質量、標準濃度的DNA，根據產物GC的含量還需要選擇合適的PCR酶。在基因工程小鼠鑒定中，使用常規的PCR酶不一定能得到好的結果，往往需要用到特殊的PCR酶，一般在定制的基因工程小鼠鑒定方案中會指出適合的PCR酶。

　　讓我們一起看看基因工程小鼠的鑒定方案吧~

雙轉基因小鼠基因型鑒定方案
Primer	Sequence 5' --> 3'			Primer Type
oIMR1644	5'-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3'			Transgene
oIMR1645	5'-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3'			Transgene
42	CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT			Internal Positive Control Forward
43	GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC			Internal Positive Control Reverse
PCR Reaction System	Reaction Conponent			Volum（μL）
	10X Buffer			2.5
	ddH2O			16.75
	Primer			1
	Primer			1
	Mg2+			2
	dNTPs			0.5
	Taq			0.25
	Template			1
	Total			25
	phanta Max from Takara
Cycling Reaction	Step	Temp	Time	Cycle
	1	95	5min
	2	95	30sec
	3	60-65	30sec
	4	72	40sec	Goto step 2, 40 cycles
	5	72	5min
	6	10	Hold
Gentype	TG：608bp Control：324bp